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          實驗指南

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          FC實驗操作流程

          2022-06-20
          417次

          FC實驗步驟

          一、細胞表面染色操作流程

          1、細胞計數:將培養好的細胞收集于15mL離心管并計數;500g離心4min,去上清;

          2、制備單細胞懸液:將收集的細胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重懸,400g離心3min,去上清,重復2次;用0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞至濃度1x106個細胞/mL,分配到96孔板中,每孔100μl細胞懸液;

          3、(可選)阻斷Fc受體:室溫孵育10-20min;

          4、一抗孵育:每孔加入稀釋后的一抗溶液100μl,2-8℃反應30min;

          5、洗滌:400g離心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸,離心去上清,重復兩遍;

          6、二抗孵育:對于非熒光染料直標抗體,加入100μl熒光二抗重懸,避光2-8℃反應30min。對于直標抗體直接跳到步驟8;

          7、洗滌:400g離心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸,離心去上清,重復兩遍;

          8、用200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞,4℃保存,上機分析。

          二、細胞胞內染色操作流程

          1、細胞計數:將培養好的細胞收集于15mL離心管并計數;500g離心4min,去上清;

          2、制備單細胞懸液:將收集的細胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重懸,400g離心3min,去上清,重復2次;用0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞至濃度1x106個細胞/mL,分配到96孔板中,每孔100μl細胞懸液,400g離心5min去上清;

          3、固定:每孔加入100μl細胞固定劑重懸細胞,2-8°孵育20min;

          4、洗滌:400g離心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸,離心去上清,重復兩遍;

          5、通透:每孔加入100μl細胞通透劑重懸細胞,室溫孵育20min;

          6、洗滌:400g離心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸,離心去上清,重復兩遍;

          7、(可選)阻斷Fc受體:10-20min;

          8、一抗孵育:每孔加入稀釋后的一抗溶液100μl,2-8℃反應30min;

          9、洗滌:400g離心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸,離心去上清,重復兩遍;

          10、二抗孵育:對于非熒光染料直標抗體,加入100μl熒光二抗重懸,避光2-8℃反應30min。對于直標抗體直接跳到步驟11;

          11、洗滌:400g離心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸,離心去上清,重復兩遍;

          12、用200μl 0.5%BSA/PBS溶液重懸細胞,4℃保存,上機分析。


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